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第二十章 水律动与组织再生工程

当老化世界来临,“再生医学”及“组织生物工程”逐渐成为未来医学发展的重点。再生医学主要使用人类的间叶干细胞来新生组织,为了操纵间叶干细胞的分化方向,科学家使用许多化学物质、药物、荷尔蒙、与生长因子,及物理因子。生物机械力非常有用,像震动、磁力、剪力等。水平律动可以产生剪力,因此可以刺激间叶干细胞,今天已成为“再生医学”重要的工具。
  当然刺激干细胞的律动机械比人使用的律动机迷你很多,但原理却是一样的。其中以血流剪力与肝脏再生的研究最多也最深入。多年来医界都明白人体肝脏有再生能力,肝脏在被部份切除后,慢慢会再长出新的肝脏组织,但是什么机转启动此再生过程呢?这些年来的研究显示:肝脏部份切除后会再生是因为血流剪力增加及一氧化氮增加的关系。因为如果使用一氧化氮合成酶抑制剂如 l-NAME,那肝脏组织的再生就会停止。肝脏再生过程必顸透过刺激内皮细胞产生一氧化氮合成酶及血管新生因子;在整个肝脏再生过程都可以侦测到这些基因表现与蛋白质的增加,使用一氧化氮合成酶抑制剂,这些表现就消失。可以证明肝脏再生确实是由血流剪力与及一氧化氮所控制。
  在干细胞之间流动的是血而是组织间液,组织间液流动产生是剪力。虽然速度与力量都较小,但与血管内的流动一样会对组长产生剪力,这种剪力会影响细胞的形态与迁移,包括纤维母细胞、癌细胞、内皮细胞及间叶干细胞等等,这是干细胞环境中所接受到的剪力,会影响人类间叶干细胞的分化、增殖、移动、及凋亡。英国格系梭以特别的机器称为来制造流体剪力刺激干细胞,他发现不同流体剪力会正向调控 MAPK signalling pathways 人类间叶干细胞的 8 个基因。中国系伟使用老鼠的骨髓的间叶干细胞,透过分析 Bcl-2/Bax 讯息 RNA 的表现,他们发现流体剪力对细胞会降低间叶干细胞的增殖速度,多数间叶干细胞会停止在细胞分裂的 G0 期与 G1 期,而且与流体剪力大小呈现剂量关系。也就是说流体剪力可以抑制间叶干细胞的凋亡。
  人类的器官中最早被应用的是皮膟与软骨,主要的原因是它们不需要有血管组织来供应血液与氧气。但其他人体组织只要大过 100 微米就需要有微血管,否则会死亡。这些年来,做组织工程的专家发现要制造出人类的血管,必顸使用内皮细胞来附着在人工纤维的管子中,而这个工作必须制造血流剪力事先操控干细胞或内皮祖细胞以发育成稳定的内皮细胞。中国林元与日本的直哉坂本以实验证明只透过物理振动产生的剪力就可以刺激人类间叶干细胞分化成内皮细胞,而且他们也发现促使内皮细胞分化的血管内皮生长因子可以累积性的制造出来。结论是适当的剪力可以诱导人类间叶干细胞制造血管内皮生长因子及刺激内皮细胞分化。这不仅可以修补受损的内皮细胞,也可能做为生物组织工程的材料。
  现在骨折或骨头缺损,基本上是使用各种合金或陶瓷的植入物。再生医学使用间叶干细胞利用特殊装置产生流体剪力刺激间叶干细胞分化成骨细胞已经有敥然的收获。
  最后研究显示透过组织间液的流动剪力即可以促进纤维母细胞变成肌肉母细胞及增加膞原纤维排列与纤维母细胞的繁殖,可以加速烫伤及其它原因伤口的愈合与复原。
  也就是说透过水平律动可以刺激肝脏再生,而透过微型水平律动机械制造出组织间液的剪力,可以操纵间叶干细胞,形成血管内皮组织、骨组织等,或修补伤口缺失,成为再生医学重要的工具。此种研究生物液体流动对于身体的影响也开拓了医学上的一门新领域,称为“生物流变科学”(Biorheological Science and Techology)。“再生医学”Regenerative medicine 或是“组织生物工程”tissue bioengineering,简单说,就是尝试在体外或体内制造人体组织与器官的技术。现在医学还没有办法复制造新的器官,如果肝脏、心脏、肾脏坏了,或是皮膟烧毁了,需要做肝脏、心脏、或肾脏移植或植皮手术,但可用的器官却非常稀少与昂贵,甚至完全不可得。需要者常常还没有等到器官就已经过逝了;即使运气好,能够等到捐赠的器官,因为不是自己的组织,还是会产生严重的器官排斥问题,受捐赠者的免疫系统会将这些外来的组织或器官当成外物不断的攻击它,经常导致这些器官衰竭而废,而病人本身则因为免疫耗尽而耗弱感染。现在的暂时取代品是人造的器官或组织如人工关节、假牙、人工瓣膜等,但医学的未来目标是重生一新的组织或器官。
  “再生工程”就不会有上述的问题,因为它是使用本身的干细胞来制造病人需要的组织与器官。人体自己本身有干细胞,婴儿刚出生时,脐带血中浓度比较高,因此市面上有许多脐带银行为父母储存婴儿的富含干细胞的脐带血。但即使一个人在出生时储存了,如果他是在 60 岁时才需要干细胞,即使公司还没消失,这些冷冻一甲子的干细胞是否仍然可以使用或是已经奉奉一息,谁也不知道?谁也不能保证?
  最好的当然是现做新鲜的干细胞!也就是从病人身上现榨的干细胞,问题是人老了还有干细胞吗?这问题很有趣,答案是肯定的!我们先想想,人体的红血球可以活120天,白血球只能活4-5天,那补充死掉的红血球与白血球生力军从那里来呢?当然是骨髓中的干细胞。同样的我们每天要100-200根头发,皮膟舌黏膜都会更新,骨头也会汰旧换新,请问这些新生细胞从那里来呢?当然也是来自干细胞。没错,人越老体内的干细胞也会越来越少,但即使到老年,人体内仍有干细胞是无庸置疑的。
  有科学家暱称干细胞是上帝的手,上帝创造万物而干细胞创造各种细胞,这种能力称为多向分化性。基本上干细胞又可以分为造血干细胞与间叶干细胞,前者主要分化为各种血球;后者则分化为许多细胞硬骨软骨脂肪血管神经细胞。
 
间叶干细胞
 
  1970 年初期苏联科学家 Alexander Friedenstein 就已经知道骨髓有一种特殊物质可以分化成不同的细胞如硬骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞等等,但是一直没有能力寻找出来。直到 1992 年才分离出来且证明其在体外分化成为硬骨骼及脂肪细胞,后续有其他的研究团队发现,此类干细胞更可以分化成为肝脏、软骨、肌肉等组织细胞,甚至神经细胞。此物质就是人类间叶干细胞。
  原来人类的干细胞有两种: 一种是造血干细胞,另一种为间叶系干细胞,所谓“间叶干细胞”(mesenchymal stem cells)存在于人类骨髓中,有极强的生长和分化能力,也能够在体外大量增殖。它们能够分化成胚胎时期中胚层的各种组织细胞,包括造骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、肌肉细胞等,这种可以生成各种不同细胞组织的能力称为“多方向分化性”,人体内只有干细胞具备这种能力。(145)
  2002年美国明尼苏达大学研究人员发现间叶干细胞更可以分化成为神经系统的细胞。这些令人兴奋的分化可塑性的表现,不但改变了原先对于成体干细胞分化能力受限制的看法,更大大的提升了间叶干细胞在细胞疗法、组织工程、以及再生医学的研究与应用价值。
  想想,如果掉了一只耳朵,有没有可能利用此种干细胞再生出一个软骨细胞构成的耳朵呢?所以可以变成各种不同细胞的间叶系干细胞,是理想的组织或器官再生物质,因为它们可以分化成各种结缔组织。令人好奇的是,间叶干细胞怎么知道它们要分化成什么细胞呢? 除了内在遗传基因的控制外,干细胞的分化是受到什么机制控制?科学家为了操纵间叶干细胞的分化方向,(总不能想种菜瓜生地瓜),可说尝试过许多化学物质、维生素、矿物质、荷尔蒙、生长因子与药物。但研究发现影响力最明显的竟然是物理因素,像震动、磁力、剪力等,此力量在体内称为生物机械力(biomechanical force)。
  最近这十年来研究显示:几乎所有人体的细胞都是对于机械讯息敏感的细胞,也就是说能感受环境中的物理变化并反应,其中尤其是肌肉细胞(24),血小板(81),内皮细胞(175),纤维母细胞(183),软骨(122)及骨细胞(218)。
 
证据 1:剪力与一氧化氮刺激肝细胞再生
 
  关于血流剪力与肝脏再生的研究最多也最深入。多年来医界都明白肝脏部份切除后慢慢会再长出新的肝脏组织,但是什么机转启动此再生过程呢?
只要能破解此秘密,会促成再生医学极大的进步。
  这些年来的研究显示:肝脏部份切除后会再生是因为血流剪力增加及一氧化氮增加的关系。研究者发现如果使用一氧化氮合成酶抑制剂如l-NAME,那肝脏组织的再生就会停止。(165) 肝脏再生过程必顸透过刺激内皮细胞产生一氧化氮合成酶及血管新生因子如 VEGF 蛋白质;在肝脏部份切除后的肝脏再生过程都可以侦测到这些基因表现与蛋白质的增加,使用一氧化氮合成酶抑制剂如 l-NAME,则这些表现就消失。可以证明肝脏再生确实是由血流剪力与及一氧化氮所控制。(212)
 
组织间液流 interstitial flow 
 
  组织间液流是液体从结缔组织穿透细胞基质外层(extracellular matrix)的流动。速度缓慢,但与血管内的流动一样会对组长产生剪力,这种剪力会影响某些特殊细胞的形态与迁移(migration),这些包括纤维母细胞、癌细胞、内皮细胞及间叶干细胞。
 
证据 2:水平剪力会影响间叶干细胞的基因
 
  人类身体细胞上有许多机械感受器,当接受到物理力量时,会产生机械传导(mechano-transduction),这种特质是现在火红的组织工程或生物再生工程技术的基础。科学家现在透过各种物理机械刺激去影响人类间叶干细胞的分化、增殖、移动、及凋亡。当然物理力量有很多种,剪力在其中扮演关键角色。人体的剪力主要是在血管中,所以是一种流体剪应力(flow-induced shear stress),英国基尔大学的格系梭(Glossop JR)以特别的机器称为流线液体剪力物反应器(streamer fluid shear bioreactor)来制造流体剪力,以力道1, 5及10 dyn/cm2 来刺激干细胞,看看剪力的影响是透过那些基因与细胞内途径。在接受流体剪力 24小时后,透过基因技术,他发现不同流体剪力会正向调控MAPK signalling pathways人类间叶干细胞的8个基因。(80)
 
证据 3:剪力抑制干细胞的凋亡

  中国武汉华中科技大学同济医院骨科的系伟(Wei Luo) 使用老鼠的骨髓的间叶干细胞,透过分析 Bcl-2/Bax 讯息 RNA 的表现,他们发现流体剪力对细胞会降低间叶干细胞的增殖速度,多数间叶干细胞会停止在细胞分裂的 G0 期与 G1 期,而且与流体剪力大小呈现剂量关系。也就是说流体剪力可以抑制间叶干细胞的凋亡。(110) 
 
证据 4:剪力刺激干细胞长出内皮细胞
 
  中国重庆大学生物流变科学技术实验室的林元教授(Lin Yuan)与日本以台东北大学(Tohoku Univsersity)的直哉坂本教授(Naoya Sakamoto)以实验证明在没有化学诱导情况下,只透过物理振动产生的剪力就可以刺激人类间叶干细胞分化成内皮细胞。他们透过萤光显微镜来检查。发现当人类间叶干细胞接受 20 dyne 的剪力 2 天,接着静态培养 5 天后,间叶干细胞的内皮细胞的特异性标记及血管内皮细胞的 VE-钙粘蛋白(VE-cadherin)和 CD31的分布与原来内皮细胞一样。再利用西方墨点分析发现,温韦伯氏血友病因子(vWF)、VE-钙粘蛋白和 CD31 蛋白质表达被明显诱发。另外他们发现促使内皮细胞分化的血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)可以累积性的制造出来,它们的量几乎是对照组的两倍。
 
  也就是说,透过剪力可以新生血管内皮组织。他们也发现如果间叶干细胞接受的剪力小于2dyne 则没有效果。证明适当的剪力是促成这新生过程的关键因素。结论是适当的剪力可以诱导人类间叶干细胞制造血管内皮生长因子及刺激内皮细胞分化。这不仅可以修补受损的内皮细胞,也可能做为生物组织工程的材料。(105) 
 
知识易开罐: CD31 
  CD31 是内皮细胞重要的蛋白质,英文为 cluster of differentiation 31,又称为血小板-内皮细胞粘附分子(Platelet endothelial cell adhesion molecule-1,PECAM-1/CD31))。
 
证据 5:剪力刺激血管再生
 
  人类的器官中最早被应用的是皮膟与软骨,主要的原因是它们不需要有血管组织来供应血液与氧气。但其他人体组织只要大过 100 微米就需要有微血管,否则会死亡。这些年来,做组织工程的专家发现要制造出人类的血管,必顸使用内皮细胞来附着在人工纤维的管子中,而这个工作必顸使用“生物反应器”来操控细胞的机械环境,也就是制造血流剪力事先操控(precondition)干细胞或内皮祖细胞以发育成稳定的内皮细胞。(135)
 
证据 6:剪力刺激骨头再生
 
  科学家发现身体上的骨细胞、造骨细胞、破骨细胞、造骨母细胞及造骨祖细胞,全部都会对机械讯息产生反应(191),而且实验显示只要利用剪力就可以刺激干细胞分化成造骨母细胞。(213)
  我们看看韩国首尔大学的黄顺郑医师(Soon Jung Hwang译音)先取出老鼠一小块5mm头盖骨,他将老鼠分成3组,一组当对照组没有接受微型的振动机刺激,另两组接受3周的微型的振动机刺激,一组在头骨缺损上加上人造鹰架,一组没有。振动停止后4周后,他们发现与比未使用律动的老鼠比较,没有鹰架的老鼠骨头体积多84%,骨头厚度多33%;有鹰架的老鼠更好,骨头体积多137%,骨头厚度多53%。(219) (图30)
  现在骨折或骨头缺损,基本上是使用各种合金或陶瓷的植入物。美国统计需使用人造骨头在2005年有100万次手术,花费达40亿美元。哈佛大学卡敦敧教授认为组织工程与再生医学利用特殊装置产生流体剪力刺激间叶干细胞分化成骨细胞,已经有收获。(93) 
 


图 30:对于老鼠的小型水平律动装置


 
证据 7:剪力加速神经细胞再生
 
  过去有一段很长时间的迷思,认为神经细胞不会再生。但慢慢的医学证据显示事实上神经细胞也能再生,此过程称为“神经再生”(neurogenesis)。如何诱导刺激此再生过程成为医学重要的开发领域,因为要治疗许多脑脊髓系统的毛病如脑中风、阿兹海默症、巴金森症、脊髓损伤等等,看来都需要透过此神经再生的成功。神经再生需要透过神经干细胞(neural stem cells) 的制造出神经祖细胞(neural progenitor),而此过程需要内皮制造一氧化氮及内皮血管生长因子(VEGF),增加血流量与新生血管。此两者则会刺激神经祖细胞增生与化成神经细胞。一氧化氮也可以刺激生成“源自大脑细胞的神经营养因子”(BDNF)进行神经重塑(neuroplasticity),改善强化记过与认知功能。一氧化氮也可以透过下视丘脑下腺肾上腺荷尔蒙轴影响自主神经系统,抑制自律神经,对抗压力降低氧化压力的伤害。(43)(178)此增加神经细胞的过程,专家称为运动学习(motor learning)(168)。
  简单来说,剪力可以刺激神经细胞再生。
 
证据 8:剪力加速伤口复原

  研究显示纯粹透过组织间液的流动剪力即可以促进纤维母细胞变成肌肉母细胞及增加膞原纤维排列与纤维母细胞的繁殖,可以加速烫伤及其它原因伤口的愈合与复原。(136)

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